网络药理学与药动学整合策略探讨香连丸治疗

NetworkpharmacologyandpharmacokineticsintegratedstrategytoinvestigatethepharmacologicalmechanismofXianglianpillonulcerativecolitis

本文所见疾病溃疡性结肠炎(UC)，一种结肠慢性炎症性肠病，导致直肠粘膜炎症。其特征为血性腹泻、直肠尿急、下坠感和不同程度的腹痛。在西医方面，主要选择是使用抗炎和免疫调节来诱导缓解（5-氨基水杨酸和皮质类固醇）。在中医方面，香连丸(XLP)是一种经典的中成药，是治疗溃疡性结肠炎的有效选择，由黄连、吴茱萸、木香组成，具有降温、除湿、止痛的功效，其药理作用与肠粘膜的恢复、屏障完整性的维持和炎症反应的减弱以及配方中化合物的含量有关。

网络药理学的思想与中医的作用机制相一致，强调协同作用和相互联系。网络药理学可以解释多种化合物和疾病靶标之间的相互作用，药物的药代动力学研究可以揭示药物的吸收效率、分布趋势和生物稳定性，从而显示药物对疾病的生物活性。

方法与结果

1、XLP指纹图谱分析与成分的定量

将XLP磨碎称重(1.0g)，加入乙腈-水5ml(5:5,v/v)搅拌。将样品置于超声波机中提取50min，离心取上清液。稀释(1.5mg/g生药)后，用高效液相色谱法测定上清液10μl。采用ACEExcel3c18色谱柱(2.1mm×mm,3μm)洗脱。柱温和自动进样器温度为25?C。样品以a(乙腈)和B(50mMKH2PO4溶液)为流动相分离。制备指纹图谱后，采用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)对XLP溶液中主要成分的含量进行定量分析，ACEExcel3c18色谱柱(2.1mm×mm,3μm)洗脱，柱温为25?C，自动进样器温为15?C。样品以a(乙腈)和B(0.1%甲酸水溶液)为流动相分离。采用多反应监测方法获取数据。如表2所示采用UHPLC-MS/MS对XLP的9种成分进行定量。

2.动物给药及分组

2.1溃疡性结肠炎小鼠实验验证：将32只雄性小鼠随机分为正常对照组、UC正常对照组、阳性对照药物SASP组和XLP组(每组8只)。UC、SASP和XLP组接受饮用水中稀释的5%右旋硫酸钠诱导UC七天。称取SASP和XLP并溶解在水中，用于SASP和XLP组小鼠的胃内给药(SASP分别为0.5g/kg和XLP为0.8g/kg)。这些药物每天服用一次，持续16天。对照组和UC的小鼠每天口服0.2ml生理盐水一次。在第17天通过颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏和结肠组织并保存。

2.2分子对接研究：分数越高，配体和受体的结合越稳定。

2.3大鼠的药代动力学研究：15只雄性大鼠在禁食12小时后随机分为三组，口服1.6g/kgXLP。一组用于药代动力学研究的采血，另外两组用于在口服给药后1h和9h收集结肠组织，给药后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、9h、12h和24h取出血样和结肠组织，并在?80?条件下保存至分析。

3.生物样品中XLP成分的测定

3.1方法验证(1)通过分析空白血浆、定量下限标准溶液加标的空白血浆和口服0.5小时后的真实大鼠血浆样品，进行特异性评估。(2)通过绘制峰面积(分析物/分析物)(Y)与血浆样品中分析物给定浓度范围(X)的比率，确定校准曲线的线性。(3)当精密度为变异系数的20%，准确度为标称浓度的20%时，测定LLOQ。(4)使用三个不同级别的质控样本评估精密度和准确度。日内和日间的准确度被评估为加标浓度值的计算浓度的相对误差。“精确”被定义为相对标准偏差。(5)通过比较提取前加标分析物和提取后加标分析物的峰值响应来测试回收率。(6)通过比较提取后加标分析物的峰响应与标准溶液的峰响应来评估基质效应。(7)通过以下条件评估稳定性:-80℃30天，冻融循环，自动进样器24h。

3.2结果：采用高效液相色谱指纹图谱对XLP中的主要化学成分进行鉴定。鉴定了6批XLP的指纹图谱，获得了满意的相似度(图1A)，表明产品具有较好的稳定性。根据标准品的色谱图和保留时间确定了XLP的5种化学成分(图1B)。(图1C)使用UHPLC-质谱/质谱方法定量测量了XLP的九种生物碱，并且检测到的化合物的化学结构显示在图1D中。

4.网络药理学

4.1PPI网络分析:UC和XLP共获得个靶点和90个靶点，筛选出50个共同靶点，确定为XLP治疗UC的潜在靶点(图2A)。PPI富集的p值1.0e?16(图2B)。此外，在PPI网络中，Jak-Stat信号通路在一个重要模块中富集(图2C)，是XLP治疗UC的重要通路。

4.2成分-靶点通路网络分析

GO富集分析显示，靶基因主要表达于突触前膜、钙通道复合物等与血液结合、G蛋白偶联胺受体活性、一氧化氮合酶调节活性，参与血液循环和细胞对有机环和含氮化合物的反应。

网络拓扑分析表明，XLP成分对溃疡性结肠炎的治疗作用是按降序排列的。该网络强调Th17细胞分化、Jak-Stat、HIF-1、HSP90AB1和IL-17信号通路(图3B)。这表明XLP可能通过调节不同节点的免疫网络来减轻炎症反应，从而对溃疡性结肠炎发挥协同作用。

4.3体内验证

XLP对UC的显著影响表现为XLP治疗小鼠的体重和结肠长度增加，DAI评分、结肠粘膜损伤和组织学评分降低，白介素-17水平恢复正常(p0.05)，CD4+Th17A+细胞百分比从0.87%下降到0.48%(p0.05)，网络药理学分析表明，Th17细胞分化是XLP缓解溃疡性结肠炎炎症反应的重要途径。

4.4分子对接

网络药理学和体内验证证实了Jak2-Stat3和HIF-1途径和HSP90对溃疡性结肠炎治疗的重要性。XLP成分主要调节Jak2-Stat3和HIF-1途径通过抑制JAk2活性，抑制下游靶点STAT3和HIF-1α的表达，而不是直接限制STAT3的活性。HSP90被证明是XLP对UC作用的重要靶点。

4.5药代动力学研究

口服XLP后，对大鼠血浆中9种成分的有效分析方法进行药代动力学研究。小檗碱、木兰碱、小檗红碱、药根碱和巴马汀的浓度-时间曲线形状相似(图6A-C)，还观察到血液暴露于吴茱萸碱和吴茱萸次碱(图6D)，黄连碱、小檗碱和木兰碱的AUC值较高(表4)。此外，去氢木香内酯在药代动力学曲线中显示出两个峰(图6E)。我们的发现表明，口服XLP后，这九种化合物可以被吸收到血液中。

根据来自XLP的9种成分的药代动力学特征，结果显示，测试成分暴露在结肠中(图6F-G)，这意味着XLP的生物活性成分分布在结肠组织中，这有利于XLP对溃疡性结肠炎的药理作用。

总结

本研究对XLP的9种成分进行了定量分析，确定为高含量化合物，网络药理学揭示了UC和9种成分之间的50个交叉基因，发现XLP通过调节免疫系统的关键途径有效地治疗溃疡性结肠炎。在小鼠中的实验验证表明，XLP能够抑制Jak2-Stat3途径，从而抑制Th17细胞的分化，从而减轻溃疡性结肠炎中的粘膜炎症。分子对接证实了八种生物碱能够与JAk2、HIF-1α和HSP90AB1结合，进一步证实了XLP对Jak2-Stat3途径的抑制作用。九种XLP化合物在血浆和结肠组织中的暴露水平具有可比性，这支持了网络药理学分析的结果，并为溃疡性结肠炎的XLP治疗机制提供了见解。

本文研究展示了一个整合药代动力学策略的网络药理学，以探索XLP主要成分在溃疡性结肠炎治疗中的药理机制。这种方法有助于加深我们对中药方剂机理的理解，促进中药方剂的进一步研究和开发。